Topo原理克隆载体

NUCLEIC ACID PURIFICATION

pBM27 Toposmart Cloning Kit克隆试剂盒

发布者:博迈德生物发布时间:2018-09-113402

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CL119-01 pBM27 Toposmart Cloning Kit克隆试剂盒 20次 680
CL119-02 20次×3 1800

保存条件:-20℃ 保存一年。

品介绍:

利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将PCR产物定向克隆到线性化的pBM27载体中。适用于克隆由PfusPfuKODXeroxPhusionQ5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物。pBM27载体类似于invitrogen公司的pENTR/D-TOPO入门载体,具有attL1attL2,为gateway系统中的入门载体。引物M13F(-21)M13R可用于菌落PCR和测序鉴定。

产品特点:

(1)连接反应仅需5分钟。

(2)只适合平末端PCR产物的快速、高效、定向克隆。

(3)载体采用了新的制备工艺,零背景,无需蓝白斑筛选

(4)可在基因的C端中融合Flag标签序列。

(5)载体为壮观霉素抗性。

注意事项:

(1) 引物要求:PCR引物5’端不能进行磷酸化修饰,普通商业化引物即可。上游引物的5’端添加CACC四个碱基(CACC为真核表达所必需的Kozak序列)。如果目的蛋白需要在C端带FLAG标签,下游引物则需要去掉基因本身的终止密码子(3个碱基),目的蛋白的翻译终止由FLAG标签的终止密码子TAA(位于Xho I酶切位点前)来实现。

(2) DNA聚合酶:选用PfusPfuPhusionQ5KODXerox 等高保真DNA聚合酶用于PCR扩增。

(3)连接时间:5-15分钟,一般为15分钟。

(4)连接温度:室温 (22-37),可使用PCR仪控温。最佳反应温度为25。若片段有高GC等复杂结构,可在37反应。

(5)产物要求:为保证PCR产物完整,建议72后延伸5-10分钟。连接前使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量和纯度,如PCR产物为非单一性条带,目的片段一定要切胶回收。如PCR产物为单一条带,无引物二聚体,可以取1-3mlPCR产物直接连接。

但若扩增模板为质粒DNA,应注意质粒的抗性。由于pBM27载体为壮观霉素抗性,以壮观霉素抗性的模板质粒扩增的PCR产物应切胶回收后再连接。

(6)片段用量:胶回收的DNA片段一般使用量为50-100ng。对照片段为5’端带CACC四个碱基的全长EGFP基因的平末端产物。

(7)M13F(-21)M13R引物干粉管加120ml灭菌水即为5mM浓度的引物。


pBM27载体图谱及多克隆位点序列 


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