PCR法的原理：

循环1：

• Step1：再含有引物、dNTP及DNA聚合酶的反应液中双链DNA热变性（94℃，1min）

• Step2：引物和热变性生成的单链DNA退货（60℃，1min）

• Step3：在DNA聚合酶作用下合成互补链（72℃，1.5min）

循环2：

扩增的双链再次热变性生成单链DNA（返回step1）

（注）不同DNA片段要达到最高的扩增效率，需要设定不同的反应条件。

影响PCR的主要因素

1、循环参数

扩增参数极大的依赖于模板、引物和热循环仪的参数。

起始DNA变性

PCR开始时的模板DNA完全变形非常关键，因为其可以确保在第一个扩增循环时高效利用模板。当模板GC含量低于或等于50%时，95℃加热1~3分钟对起始DNA变性是足够的，对于GC-rich的模板，该步骤可延长至10分钟。如需使用更长的起始变性时间或需要更高的变性温度，可在DNA变形后加入Taq DNA Polymerase，这样可避免酶活性下降。Pfu DNA Polymerase热稳定性更好，因此可忍受长时间起始变性过程。

热启动PCR：热启动PCR使用的Taq DNA Polymerase在室温下没有活性，需要95℃起始变性/酶激活过程。

变性

通常情况下，每个循环时94~95℃加热0.5~2分钟变性DNA是足够的。对于GC-rich的DNA模板，该步骤可以延长至3~4分钟。反应体系中加入10~15%甘油或10%DMSO、5%甲酰胺或者1~1.5M三甲酰胺乙内酯可以增强DNA变性效果。当这些试剂存在时，引物-模板复合物的溶解温度急剧下降，因此退货温度需相应的调整。此外10%DMSO和5%甲酰胺可抑制DNa聚合酶的50%活性，因此使用这些添加剂时需适当的增加酶量。

引物退火

退火温度应该比最低的引物-模板复合物溶解温度（Tm）低5℃。退火0.5~2分钟通常是足够的。如果扩增出现非特异性PCR产物，需逐步优化退火温度（每次升温1~2℃）。当使用添加剂（甘油、DMSO、甲酰胺和三甲胺乙内酯）改变引物-模板复合物融解温度时，其退火温度也需相应调整。

递减PCR：某些实验PCR时使用的引物在常规循环条件下会产生非特异性扩增。在这种情况下，使用常规PCR的改良方法-递减PCR来降低非特异性的扩增。再PCR的前几个循环中，选择的退火温度高于引物溶解温度；然后退火温度每隔1个或2个循环降低1℃直到达到理想的或实验设定的退火温度。在剩下的循环中选择设定的退火温度。通过这种方法，目标产物的富集程度高于非特异性产物。

延伸

Taq DNA Polymerase和Pfu DNA Polymerase在70~75℃的DNA合成速率最高。通常情况下，Taq DNA Polymerase扩增2kb产物的延伸条件是72℃ 1分钟。对于更长的扩增产物，延伸时间需相应地延长（1分钟/kb）。Pfu DNA Polymerase的合成速率较低，延伸时间估计为2分钟/kb。

长片段PCR：如需扩增长片段模板（>6kb)，推荐延伸温度降为68℃，这样可以避免长时间延伸引起的酶活性损失。

循环数

循环数依赖于PCR反应混合物中的模板DNA用量和PCR产物的预期产量。

当反应混合物中的目标序列低于10个拷贝数时，需扩增40个循环。模板含量较高时通常只需扩增25~35个循环。

最后延伸

最后一个循环结束后，推荐72℃延长孵育PCR混合物5~15分钟，这样可补平扩增产物的突出末端。如果将PCR产物克隆入TA载体，最后延伸步骤可延长至30分钟，确保PCR产物3-dA加尾反应的最高效率。

2、引物设计

要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两端与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5‘端决定扩增产物的两个5’末端位置。由此课件，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更为重要。

影响PCR特异性的因素

通过上述内容可以看出有许多因素可以影响PCR的特异性，在此我们作一归纳，供大家参考：

1. 退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。

2. 减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。

3. 引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。

4. 改变MgCl2（有时KCL）浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。

5. 模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发卡结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮-2‘-脱氧鸟苷-5’-三磷酸（7-deaza-2'-deoxyguanosine-5'-trihosphate)(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3:1的混合物（150μmol/1de7GTP+50μmol/L dGTP)代替200μmol/L dGTP,则可阻非特异性产物的生成。