无缝克隆的灵活应用让其成为构建载体的主流方法。其主要的步骤在于重组引物的设计。

下面我们就简单聊一下重组引物的设计

重组引物包括重组臂(15-25bp)和特异性序列(18-25bp)，以下图片仅展示载体上重组臂设计。

1.保留酶切位点与不保留酶切位点

如使用HindIII和BmaHI酶切载体

图1

2.不在酶切载体位点插入序列，而选择其他位点插入。

如使用BamHI和EcoRI双酶切载体，但是片段插入到HindIII和XbaI位点处。

图2

3.引入其他酶切位点

如使用HindIII和XbaI双酶切载体，F方向引物引入BglII酶切位点。

引入的酶切位点可以在加到HindIII位点前，也可以在保留HindIII位点的情况下其位点后。在R方向引入酶切位点亦然。

图3

4.含有ATG的酶切位点

含有ATG的酶切位点注意不要移码。

如使用NcoI和SpeI双酶切载体，注意NcoI的ATG位点。

图4

当然无缝克隆在构建载体时还有很多其它灵活应用，这里只是简单介绍一下，相信您有更多更好的应用。