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普通引物合成

DNA合成常见问题与分析

发布者:博迈德生物2018-01-184134


1. 引物纯化方式有哪些,如何选择?


    C18柱脱盐:这是一种活性碳柱子,有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,DNA可以被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。


    OPC:合成DNA寡核苷酸片段(Oligo)的最终产物上带有DMT。OPC纯化就是基于DMT与树脂的亲合力。Oligo上只有最后一个碱基带有DMT,其它碱基的DMT基团在逐步的合成过程中已被去除。因此,原则上只有真正所要合成的DNA片段末端有DMT,而短片段杂质末端无DMT。


   OPC柱中装有对DMT具有亲和力的树脂,所有合成产物吸附在OPC柱上以后,用稀的有机溶剂洗柱,带有DMT的片段吸附能力强,不易被洗脱,不带有DMT的片段吸附能力弱,被洗脱。然后用三氟乙酸TFA脱去DMT基团,再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。这种方法的优点是快速,简易。但是其专一性吸附DMT能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,特别是对长碱基的纯化效果不一定理想。长片段建议使用PAGE纯化。


    PAGE:它是依据DNA片段在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时的迁移率不同来分离大小片段的。由于各分子所带电荷和大小不同,综合影响其在凝胶中的迁移速度,大片段迁移得慢,经过一定时间的电泳,大小片段会分开,然后停止电泳,剥离凝胶,置于荧光TLC板上在紫外灯下切割目的条带,浸泡碎胶,并从泡胶的盐溶液中回收目的DNA。优点是纯化效果很好、尤其是纯化长链效果更好、而且是可以直观看见DNA片段合成情况的质控环节。缺点是费人工、电泳及后处理过程中样品损失量大。


2.需要什么级别的引物?


3. 需要合成多少OD数?

    根据实验目的确定。一般PCR扩增,2OD引物,可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接,1OD就足够了。但是有些研究人员,就做几次PCR,却要5-10OD。做全基因构建的引物都比较长,但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长,最后全长得率就越低,割胶越多,出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求,其实也是对社会资源的一种浪费,同时也从一个侧面反映了部分研究人员,特别是新手的自信心不足。引物用量过大,容易引起非特异性扩增。


4. 投诉定量不准是怎么回事儿?

    可能存在如:定量错误,分装问题,系统误差等(10%左右是允许的)现象,而客户投诉的大部分原因是:因为没有能够正确理解引物OD数的含义,没有能够正确使用分光光度计,特别是使用微量测定;用户没有将OD读数,正确地转换成母液中OD数。这种情况比较常见。例如:验证标有2OD引物的简单做法是:加入1ml水,彻底溶解混匀后,取100ul,加入装有900ul水,光径为1cm的石英比色皿中操作方法好象不对,波长260nm,此时光吸收的读数为0.2。其他情况如用户收到引物干粉时,打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。


5. 如何计算引物的浓度?

    引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成50-100pmol/ul。溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致,请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
    一般情况下,我们建议将引物的浓度配制成100umol/L,加水的体积(微升)按下列方式计算:V(微升)=OD数*(乘)30*(乘)1000/(除)引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度,按上述公式换算。
    注意:1OD260=30ug/ml


6. 如何计算引物的Tm值?

   引物设计软件都可以给出Tm,Tm与引物长度、碱基组成及所使用缓冲液的离子强度有关。
    长度为25mer以下的引物,Tm的近似计算公式为:Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)
    对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为:
    Tm=81.5+16.6xLog10[一价阳离子]+0.41(%GC)–600/size
    公式中,Size=引物长度。


7. 引物(含修饰)的分子量是如何确定的?

    MW=(NA*WA)+(NC*WC)+(NG*WG)+(NT*WT)+(Nmod*Wmod)+(Nx*Wx)+(Ni*Wi)+16*Ns–62
    NA,NG,NC,NT,Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量,WA,WC,WG,W,Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod分别为修饰基团的数目和分子量
    对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数,例如G+A混合的分子量为(313.21+329.21)/2 =321.21。Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16



8. Oligo DNA最长可以合成多少个碱基?

    以每步反应效率为99%进行计算,粗略计算合成到100bp时,目的DNA片段的比例便为37%。建议合成长度在100mer以内,比较长的的DNA片段,建议在本公司的基因合成部合成。


9. 寡核苷酸一般以何种形式提供?如何溶解?

    我们一般以干粉形式提供寡核苷酸,呈白色或无色透明状。
建议使用TE buffer溶解,如果实验条件限制,也可以使用双蒸水或者去离子水等不影响后续实验的缓冲液。


10. 寡核苷酸在使用时有哪些问题需要注意?怎样保存?

    我们提供的寡核苷酸是干粉形式的,有时会离开管底,因此在第一次开盖前离心或者将管底朝下在桌子上轻叩几次,将其收集到管子底部。
    干粉状的DNA在-20摄氏度 可以保存1年之久,但溶解后的保存时间要大大缩短。保存时间与所用的水中有无核酸酶、PH值和环境温度等外在条件有密切的关系。我们公司一般默认提供两管引物,建议先将一管配成较高浓度的引物溶液,置于-20摄氏度 的保存环境中,可以存放数周,这样可以避免因反复冻融而造成的污染与破坏。


11. 引物溶解后发现有微量沉淀,会影响实验结果吗?

    纯化时偶尔会有微量的树脂进入纯化好的产品中,不影响任何反应结果,请稍许离心后取上清使用。


12. 引物检测方法

    建议使用分辨率比较高的聚丙烯酰胺凝胶来检测(浓度16%左右)。检测后剥离凝胶,置于荧光TLC板上在紫外灯下观察条带的分布或者亮度。也可以用EB染色后观察,但是EB等染色剂的染色是嵌入DNA的双链之间的,而合成的Oligo DNA是单链,Oligo DNA自身形成的立体结构越复杂,EB的染色就越容易,DNA带也就越亮。相反,有一些Oligo DNA由于不形成高级结构,根本就不为EB所染色,导致条带弱甚至是无条带,可能会出现EB染色后不能观测到或者DNA跑不开,故不建议使用琼脂糖凝胶电泳检测引物纯度与量。


13. 已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?

    如果您溶解引物的水的PH值过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混匀,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mM Tris(pH=7.5)的缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。


14. 引物是经过PAGE纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?

    理论上分析型PAGE变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳,上样量都是非常大,电泳时的条带非常宽,带与带之间有重叠,分辨率已下降,电泳后割带回收目的引物时,很难说不割到差别仅几个碱基的引物。


15. 一般的合成OligoDNA的5和3末端有磷酸根吗?

    没有,5’和3’末端均为羟基。如需要加磷酸末端,订货时请特别注明,需另收取费用。


16. 简并引物使用应该注意什么?

    简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物,次黄嘌呤可以同所有的碱基配对,降低引物的退火温度。
    使用时注意

    ①不要在引物的3 '端使用简并碱基,最后三个碱基的退火温度足以在错误位点起始PCR

    ②使用稍高的引物浓度(1uM-3uM),许多简并混合物中的引物不是特异性针对模板的

    ③简并引物应选用简并程度低的密码子

    ④3'端不应存简并性,否则可能出现产量低而看不见扩增产物

    ⑤最好不用来测序


17. PCR产物只有单引物形成的非特异性条带?

    引物特异性不好,建议重新设计引物。


18. 检测PCR产物时,经常看到下面有很多明显的引物二聚体形成的亮带?

    可以通过减少引物的用量或者减少循环次数来避免引物二聚体产生,如果这样做效果还不明显,再考虑引物的问题,说明引物之间容易形成互补的配对结构。


19. 引物设计参考

    ①引物的3’最好是C或者G,或者CG,GC,能促进引物通过G与模板结合。

    ②设计的引物最好有接近的Tm值

    ③避免引物3’互补或者自身互补

    ④避免引物3’有三个G或者C,避免在扩增高CG含量的模板时产生错配引物的退火温度主要是指引物与模板退火的温度,不包括酶切位点


20. 引物是我们设计的,现在您扩不出来,我们要负责吗?

    不负责任。引物设计好,我们都会发给您确认。设计引物时我们遵循一般的指导原则,由于影响后期实验的因素很多,因此,我们不负责后续续问题,但可以根据客户要求重新设计。


21. 合成的引物进行 PCR 反应时无目的条带,怎么办?

    PCR反应失败的原因很多,可以从以下几个方面考虑。

    ①引物和模板是否配对,同源性有多大?

    ②引物本身是否有高级结构,或者二条引物之间是否形成高级结构?

    ③PCR反应所用试剂是否能正常工作?

    ④PCR仪是否能正常工作?

    ⑤PCR反应条件是否合适?

    如果一切正常,还无法解决问题时,我们会重新检测引物,必要时免费重新合成。


22. PCR扩增有很强的非特异条带,说明引物有污染吗?

    扩增目标很弱或没有,非特异性条带很亮,一般是模板污染(如RNA中污染基因组)或扩增条件不合适所致,换模板或者改变扩增条件,如降低退火温度等。如果有主带,还有非特异性条带,需要适当提高退火温度。


23. PCR产物克隆后测序发现引物碱基有错误,或是缺失突变碱基,为什么?

    ①合成过程中,碱基附加至DNA片段之前,碱基和碱基之间发生了偶联,然后再附加到了DNA片段上,造成多碱基现象。

    ②合成时碱基G可能会转化成烯醇异构体,此时进行PCR反应时G会转变成A。

    ③合成过程中的脱嘌呤作用,对脱嘌呤后的碱基DNA聚合酶不能识别,此时可能观察到A或G的缺失。嘌呤含量越高,就越容易发生这种情况。

    ④不完全的脱保护结果。通常C脱的快,G脱的慢。不完全脱保护会发生碱基缺失。

    ⑤合成过程中的Capping(盖帽)反应不完全,使短片段DNA继续参与合成,造成碱基缺失。

    ⑥2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A,测序就会发现碱基G-A置换。


    应该说,上述这些情况发生的可能性都极低。合成的DNA链越长,发生这种情况的机率也就越大。多数问题的出现是PCR过程和克隆过程中引入的错误。如果出现这种情况,你可以,重新挑取克隆测序,有可能找到序列正确的克隆。可以要求我们重新免费合成引物 ,我们不承担其他连带责任。


24. 为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来?

    如果您怀疑引物的问题,请您首先测定您溶解的引物的OD值,看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的,请您告诉我们公司您的引物编号,我们会复查留存样品。如不明原因,我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增,请您查找其它原因,很可能是酶或者条件不够成熟。



    OLA技术是通过两步来完成的,先用PCR技术进行扩增,再将PCR产物变性为单链;然后加入两条互补于待测SNP位点一侧序列的等位基因特异性探针和一条互补于待测SNP位点另一侧序列的公共探针,在DNA连接酶的作用下,与目标DNA 单链完全互补的等位基因特异性探针和公共探针发生连接反应。


25. 长链引物为什么出错的几率非常高?

    引物合成时,每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入,缺失,置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长,突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失,这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增,不可能绝对保证扩增产物中没有突变,引物合成也不可能保证100%正确。要知道,引物合成中发生错误(非人为因素)的频率,比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做长链引物合成,您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。


26. PCR扩增不出就引物有问题吗?

    基本不是。当今发展的各种的PCR扩增技术,各种的高温聚合酶,就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出,扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增,GC含量高的片段,非要采用特殊扩增手段才能扩增出来。

    引物扩增不出,主要是下列两种情况比较常见

    ①RT-PCR:请注意,很多基因通过常规RT–PCR方法是很难扩增出来的。RT-PCR成功的关键在于RT反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中的含量。

    ②从基因组中扩增:一般情况下,基因在基因组中都是单拷贝,基因组作为模板需要严格控制用量,基因组DNA过高,会影响反应体系中的Mg和pH。


27. 测序发现引物有突变是怎么回事?

    测序发现引物区域有突变,特别是40个碱基以下的引物,发生的概率不大,但是肯定也会发生。用户一般可以放心,引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的,碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法,预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释,人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样,采用的机器也基本相同,合成主要原料都是由少数的几家跨国公司提供的,所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似,没有人可以超脱。


    引物合成是一种多步骤的化学反应,合成效率最高也就是99%,副产品不可能避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复,一般认为,偶联过程中,正在偶联的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去,故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变,一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的,Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物,在下一轮偶联时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变,产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护,即引物上可能含有残留保护基团,引物的这些区域不能很好地与互补链配对,当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中,可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体(脱嘌呤),2,6diaminopurine,DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A,测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解,测序就会发现碱基G或A的缺失。