由于二级结构或者其它内在因素的影响，复杂结构对于测序是巨大的挑战。常规的测序方案往往容易出现提前中断或者测序结果紊乱的现象。

    样品的复杂结构主要有以下几种情况：

1. Poly结构：一般认为7个以上碱基的重复就可以称之为poly结构。

    PolyA/T结构通常致其后的峰图出现重叠峰，PolyG/C结构通常致其后的峰图出现信号衰减。Poly结构是导致测序失败最常见的原因之一，还没有非常有效的方法彻底解决Poly结构的影响，但一般而言，PCR样品Poly结构后双峰的概率比较高，而菌液中Poly结构对测序结果的影响较少或没有。

    解决办法：1.反向测序再拼接    2.连接到载体后测序

2. 重复序列：2个或2个以上碱基的多个连续重复。

    可能的原因：样品中含有重复序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致Frame滑动，较短的重复序列会导致测序结果出现移码；而较长的重复序列会使定序信号衰减。

    解决办法：反向测序有时能够顺利的通过重復序列区域(但不是一定都能够)，通过多次的测序结果比对，拼接可以得到全序列结果。

3. 高GC含量：GC含量>60%的模板，或者局部高GC含量的模板。

    采用普通测序Buffer，结果很不理想；用高GC Buffer等进行系统优化后，往往能达到理想的效果。下面三组图片，是我们公司对高GC含量基因测序过程中优化前后的对比图。

图1

图2

图3

4. 发夹结构：包含两个反向重复序列，两个重复序列之间间隔至少3个碱基。

    在测序中，有这种结构的存在是导致测序列失败。到目前为止，也是测序列中遇到的一个题。我们公司采用特殊的Buffer进行了优化，测序列效果有了很大的转让变，但并能保证所有的发夹结构都能顺利测出序列，尽我们最好的努力来为您决测序列中您遇到的难题。下面的A、B个图片分别是优化前后的对比：

图A

图B